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生物化学第十三章重组DNA技术

来源:转载 2018-1-10 过医考,上临医网! 医考过关题库免费下载
生物化学第十三章重组DNA技术考试重点!

一、重组DNA技术的概述
  1.概念:
  克隆:来自同一母本的所有副本或者拷贝的集合。
  基因工程:获得大量DNA拷贝的过程。
  具体就是说:基因工程在分子水平上对基因进行操作的复杂技术,是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内,使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
  它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新技术。

  基因重组包括:接合、转化、转导或转座。
  基因转换:减数分裂过程中两条染色体非同源DNA片段的转移,不属于基因重组。

  重组DNA的连接包括:
  外源DNA片段和线状质粒载体的连接,也就是在双链DNA 5 ’磷酸和相邻的3’羟基之间形成的新的共价键。
  粘端连接
  平端DNA连接
  质粒载体中的快速克隆

  限制性核酸内切酶:识别特异DNA序列,在识别位点及周围切割双链DNA的酶。
  限制性内切酶可分为两大类,即I类酶和II酶。相当一部分酶(如EcoR I、BamH I、Hind等)的切口,作用点有180°旋转对称性,因而可形成粘性末端,但也有一些II类酶如 A1u I、BsuR I、Bal I、Hal III、HPa I、Sma I等切割DNA分子并不产生粘性末端,而只形成平整末端。

  基因载体:噬菌体、病毒和质粒
  质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。 已发现有质粒的细菌有几百种,已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
  理想质粒载体条件:
  1.复制起始点。
  2.有两种以上易被检测的选择性标记。
  3.选择标记上具有多种限制酶的单一切点。
  4.有尽可能小的相对分子质量。
  5.属于松弛复制型。
  6.为非传递性质粒。

  相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化,这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。
  实际上在有克隆用途中,T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下述反应条件下,它就能有效地将平端DNA片段连接起来。
  pBR322质粒: DNA分子的长度为4363bp,此载体中有两个标记基因,一个是氨苄青霉素抗性基因(Apr),另一个是四环素抗性基因(Tetr)。现在已知pBR322DNA分子共有24种核酸内切限制酶的单一识别位点。其中7种限制酶(从12:00位置按顺时针方向)即EcoRV,NheI,BamHI,SphI,SalI,XmaIII和NruI的识别位点位于四环素抗性基因内部,另外有2 种限制酶即ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内,在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr的失活。
  穿梭质粒:环形双链DNA,具有两个复制起始点,一个可在大肠杆菌中推动它的复制,另一个可在酵母细胞中推动复制
  噬菌体:是寄生在细菌的病毒。M13是一类特异的大肠杆菌噬菌体,含单链环状的DNA。它感染细菌(宿主菌)呈溶原状态生长,在菌体内形成过渡阶段双链环状复制型DNA

  聚合酶链式反应(PCR):模板、酶、引物构成的体系,变性、退火、延伸可以得到大量的DNA拷贝的过程。
  PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
  PCR变性温度一般为:95℃,加热3-5分钟
  PCR引物退火温度一般为:40℃~60℃
  引物延伸温度一般为:72℃
  Klenow DNA聚合酶:大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段,它可用于填补DNA单链末端成为双链。
  Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌
  (Thermusaquaticus)yT1株分离提取的。
  2.基因工程基本原理
  分、切、接、转、筛,即:
  (1)目的基因的获取
  (2)克隆基因载体的选择与改造
  (3)目的基因与载体的连接
  (4)重组DNA分子导入受体细胞
  (5)筛选出感兴趣基因
  Western印迹杂交,是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离,再转移到杂交膜(blot)上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
  Northern印迹用于检测RNA.
  Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法
  二、基因工程与医学
  1.疾病相关基因的发现
  2.生物制药
  3.基因诊断
  4.基因治疗(导入具有相应功能的外源基因)
  5.遗传病的防治
  本章重点
  重组DNA技术的一些重点概念  


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